Trước năm 2004, địa bàn huyện Thới Lai ngày nay thuộc huyện Ô Môn, tỉnh Cần Thơ.

Ngày 26 tháng 11 năm 2003, Quốc hội Việt Nam thông qua Nghị quyết số 22/2003/QH11 về việc chia và điều chỉnh địa giới hành chính một số tỉnh. Theo đó, chia tỉnh Cần Thơ thành thành phố Cần Thơ trực thuộc trung ương và tỉnh Hậu Giang.

Ngày 02 tháng 01 năm 2004, Chính phủ Việt Nam ban hành Nghị định số 05/2004/NĐ-CP[2] về việc thành lập các quận Ninh Kiều, Bình Thủy, Cái Răng, Ô Môn, các huyện Phong Điền, Cờ Đỏ, Vĩnh Thạnh, Thốt Nốt và các xã, phường, thị trấn thuộc thành phố Cần Thơ trực thuộc Trung ương. Từ năm 2004 đến năm 2008, huyện Thới Lai lại thuộc địa phận huyện Cờ Đỏ, thành phố Cần Thơ.

Ngày 23 tháng 12 năm 2008, Chính phủ Việt Nam ban hành Nghị định số 12/NĐ-CP[3] về việc điều chỉnh địa giới hành chính xã, thành lập xã thuộc huyện Thốt Nốt, huyện Vĩnh Thạnh, huyện Cờ Đỏ, thành lập quận Thốt Nốt và các phường trực thuộc, điều chỉnh địa giới hành chính huyện Cờ Đỏ để thành lập huyện Thới Lai thuộc thành phố Cần Thơ. Nội dung Nghị định về việc thành lập huyện Thới Lai như sau:

Thành lập huyện Thới Lai thuộc thành phố Cần Thơ trên cơ sở điều chỉnh 25.566,30 ha diện tích tự nhiên và 126.842 nhân khẩu của huyện Cờ Đỏ (bao gồm toàn bộ diện tích tự nhiên và nhân khẩu của 13 đơn vị hành chính trực thuộc, gồm các xã: Thới Thạnh, Tân Thạnh, Định Môn, Trường Thành, Trường Xuân, Trường Xuân A, Trường Xuân B, Trường Thắng, Xuân Thắng, Thới Tân, Đông Bình, Đông Thuận và thị trấn Thới Lai).

Huyện Thới Lai có 25.566,30 ha diện tích tự nhiên và 126.842 nhân khẩu, có 13 đơn vị hành chính trực thuộc, gồm các xã: Thới Thạnh, Tân Thạnh, Định Môn, Trường Thành, Trường Xuân, Trường Xuân A, Trường Xuân B, Trường Thắng, Xuân Thắng, Thới Tân, Đông Bình, Đông Thuận và thị trấn Thới Lai.